蘑菇醇的抑菌活性及其保鮮應(yīng)用

作為食源性病原體，蠟樣芽孢桿菌不僅產(chǎn)生污染食物、威脅人體健康的毒素，還依靠孢子抵抗極端環(huán)境。由于受氣候、土壤、種植及儲(chǔ)存環(huán)境影響，小麥易受到微生物的污染，繼而被引入成品饅頭。食品中的蠟樣芽孢桿菌超過10⁵CFU/g就會(huì)產(chǎn)生致嘔吐型毒素和致腹瀉型毒素，因此蠟樣芽孢桿菌的超標(biāo)常導(dǎo)致食源性疾病暴發(fā)。金黃色葡萄球菌也是一種常見的食源性致病菌，廣泛存在于環(huán)境中。感染金黃色葡萄球菌的患者在感染后的6～48h內(nèi)，通常會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、惡心、腹部絞痛等癥狀。金黃色葡萄球菌在米面制品中分布廣泛。

蘑菇醇又名1-辛烯-3醇，分子式C₈H₁₆O，為脂肪族不飽和醇，呈無色至淡黃色油狀液體，是使蘑菇呈現(xiàn)香味的主要成分。自然界中主要存在于薄荷類、百里香及鮮蘑菇中，屬天然等同香料，在GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定為允許使用的食用香料。蘑菇醇是饅頭中的主要呈香物質(zhì)之一，由面團(tuán)中的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生，對(duì)饅頭香味有積極貢獻(xiàn)。有研究表明，蘑菇醇在控制病原體方面具有潛在的應(yīng)用前景。

結(jié)果與分析

最低抑菌濃度（MIC）和    最低殺菌濃度（MBC）值

MIC和MBC是評(píng)價(jià)抑菌劑對(duì)特定微生物抑制和殺死效果的常用指標(biāo)，常用于抑菌劑的研究中。選用饅頭中常見的2種細(xì)菌金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢為指示菌，測(cè)定了蘑菇醇溶液的體外抑菌效果。由圖1可知，蘑菇醇對(duì)金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的MIC為1mg/mL，MBC為2mg/mL。在面米制品中，主要防腐劑添加量為脫氫醋酸鈉0.3～0.5g/kg、丙酸鈣2.5g/kg、山梨酸鉀1g/kg，但它們均為化學(xué)合成且單獨(dú)使用效果不佳，需要復(fù)配使用才能達(dá)到最佳效果，而使用少量的蘑菇醇即能達(dá)到抗菌效果。青花椒精油對(duì)蠟樣芽孢桿菌的MIC和MBC分別為2.0、4.0mg/mL。研究發(fā)現(xiàn)辣木籽抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為4mg/mL和8mg/mL。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)葉小檗果小檗堿對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為3.30mg/mL。以上結(jié)果表明，蘑菇醇對(duì)金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌具有優(yōu)異的抑菌性能。Tween-20為水包油(O/W)型乳化劑，加入蘑菇醇溶液中會(huì)略微增加吸光度值，所以4 mg/mL的蘑菇醇溶液OD₆₀₀相比2、1mg/mL的吸光度值略大，但與陽性吸光度值差異明顯，對(duì)結(jié)果影響較小。

牛津杯法驗(yàn)證

由表2可知，蘑菇醇對(duì)2種常見細(xì)菌均有抑制作用，且抑菌效果隨著其濃度增加而增強(qiáng)。在平板上，與對(duì)照相比，1mg/mL蘑菇醇具有明顯的抑菌圈，MIC和MBC濃度的蘑菇醇對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到7.16mm和10.86mm，對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到了6.36mm和9.42mm，與吸光度的結(jié)果相一致。進(jìn)一步說明1mg/mL濃度的蘑菇醇對(duì)細(xì)菌有抑制效果，2mg/mL的蘑菇醇濃度對(duì)細(xì)菌有殺傷效果。

流式細(xì)胞分析儀（FCM）

檢測(cè)蘑菇醇?xì)⒕芰?/strong>

Calcein AM和PI對(duì)蘑菇醇處理的細(xì)菌進(jìn)行聯(lián)合雙重染色觀察，根據(jù)Calcein AM/PI差異染色特征鑒定亞群，可檢驗(yàn)細(xì)胞是否進(jìn)入亞致死狀態(tài)。第一象限(Q1-2)限對(duì)應(yīng)亞致死細(xì)胞，具有亞致死損傷，伴有殘留酯酶或裂解細(xì)胞；第二象限(Q1-1)對(duì)應(yīng)死亡細(xì)胞；第三象限(Q1-3)對(duì)應(yīng)細(xì)胞碎片或者未染色細(xì)胞；第四象限(Q1-4)對(duì)應(yīng)完整細(xì)胞，具有高酯酶活性和完整的膜。

由圖2可知，經(jīng)蘑菇醇處理以后的4個(gè)象限發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化，說明細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變。用1mg/mL濃度蘑菇醇處理過的金黃色葡萄球菌死亡細(xì)胞和受損細(xì)胞由27.37%上升到90.83%，其中死亡細(xì)胞增加了4.61%，損傷細(xì)胞增加了58.85%；蠟樣芽孢桿菌死亡細(xì)胞和受損細(xì)胞由25.97%上升到93.14%，其中死亡細(xì)胞增加了0.59%，受損細(xì)胞增加了66.58%。FCM的檢測(cè)結(jié)果顯示，MIC濃度的蘑菇醇處理過后使得PI染料穿過破損細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，增加了受損細(xì)胞的百分比。

細(xì)胞膜滲透性觀察結(jié)果

倒置熒光顯微鏡用于觀察蘑菇醇處理后對(duì)金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞膜完整性和通透性的影響。由圖3可知，經(jīng)過PI染色后可區(qū)分細(xì)胞膜完整的細(xì)胞和膜受損細(xì)胞，PI會(huì)進(jìn)入細(xì)胞膜破損的細(xì)胞并將其染成紅色，而活細(xì)胞則不會(huì)被染色。未經(jīng)蘑菇醇處理的空白對(duì)照組(圖3A、圖3C)細(xì)胞樣品染色后紅色熒光較少，而經(jīng)過1mg/mL蘑菇醇處理2 h后的樣品中紅色熒光增強(qiáng)，說明經(jīng)過蘑菇醇處理后金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的細(xì)胞膜遭到破壞(圖3B、圖3D)，通透性有所增加。倒置熒光顯微鏡進(jìn)一步驗(yàn)證了蘑菇醇處理對(duì)細(xì)胞膜具有破壞作用，從而導(dǎo)致細(xì)菌活性降低或失活。

不同濃度的蘑菇醇對(duì)

微生物數(shù)量的影響

剛蒸制完成的饅頭中微生物主要來源于原料和加工冷卻過程中引入的耐熱菌數(shù)目，且饅頭富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，非常適宜微生物生長(zhǎng)繁殖。因此，微生物在剛制作完成的饅頭中迅速生長(zhǎng)繁殖，并迅速在24h達(dá)到5 lgCFU/g，此后，由于基質(zhì)的消耗以及菌群的競(jìng)爭(zhēng)，增殖速度逐漸減緩。微生物在饅頭中的生長(zhǎng)曲線與在基質(zhì)中生長(zhǎng)曲線類似，呈S形。

由圖4A、圖4B可知，饅頭表皮的菌落總數(shù)起始值在2.15～2.31 lgCFU/g，同時(shí)期的饅頭內(nèi)部的菌落總數(shù)低于饅頭表皮的菌落總數(shù)，饅頭內(nèi)部比饅頭表皮低1.56～2.68 lgCFU/g。饅頭在保存過程中水分一直在流失，在表皮形成了較低的水分活度。面包中較低的水分活度會(huì)在其表面形成一層硬殼，從而能阻止微生物進(jìn)入內(nèi)部繁殖，饅頭表皮菌落總數(shù)高于內(nèi)部的原因可能與之相同。霉菌/酵母菌起始數(shù)量低于2 lgCFU/g，直至36h仍處在較低水平，在2.00 lgCFU/g以下，且在60h內(nèi)保持在3.00 lgCFU/g。MIC濃度的蘑菇醇饅頭表皮與內(nèi)部的菌落總數(shù)和酵母/霉菌數(shù)量生長(zhǎng)均低于其他組和對(duì)照饅頭。在整個(gè)保藏過程中，蘑菇醇饅頭菌落總數(shù)總是低于對(duì)照饅頭，這說明蘑菇醇饅頭對(duì)微生物具有抑制作用。在儲(chǔ)藏期間，相比對(duì)照最多降低了2.65 lgCFU/g菌落總數(shù)，1.80 lgCFU/g的霉菌/酵母菌數(shù)量。常溫儲(chǔ)存72h后饅頭外觀圖見圖5。

不同濃度的蘑菇醇對(duì)

比容的影響

饅頭比容表征單位質(zhì)量的饅頭體積，是影響?zhàn)z頭品質(zhì)的重要原因之一。由圖6可知，所有饅頭的比容均超過小麥粉饅頭中＞1.7的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，MIC添加量蘑菇醇的饅頭與對(duì)照饅頭的比容具有顯著差異(P<0.05)，添加MIC的蘑菇醇的饅頭比容最大，可能是因?yàn)?mg/mL的蘑菇醇抑制了細(xì)菌的活性，但遠(yuǎn)低于酵母抑制其最低抑菌濃度8mg/mL，從而使得細(xì)菌菌群的競(jìng)爭(zhēng)力減弱，酵母競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)。添加1/2和1/4MIC蘑菇醇之間的饅頭比容沒有顯著性差異，對(duì)照組的比容最低為1.94。

不同濃度的蘑菇醇

對(duì)質(zhì)構(gòu)特性的影響

饅頭質(zhì)構(gòu)分析可采用質(zhì)地性狀和壓縮張弛性綜合指標(biāo)。質(zhì)地性狀與饅頭品質(zhì)成負(fù)相關(guān)，數(shù)值越大，表示饅頭越硬度大且黏牙，計(jì)算方式為硬度、黏性與咀嚼性的乘積。壓縮張弛性與饅頭品質(zhì)呈正相關(guān)，數(shù)值越大，表明饅頭越有彈性、口感越好且有嚼勁，計(jì)算方式為彈性、內(nèi)聚性與回復(fù)性的乘積。由表3可知，質(zhì)地性狀1/4MIC(3.0×10⁹)＞對(duì)照(4.4×10⁷)＞1/2MIC(2.9×10⁸)＞1MIC(6.9×10⁷)，添加量MIC濃度蘑菇醇的饅頭質(zhì)地性狀最好。壓縮張弛性1MIC(0.44)＞1/2MIC(0.43)＞1/4MIC(0.41)＝對(duì)照(0.41)，添加量1MIC濃度蘑菇醇的饅頭壓縮張弛性最好。

感官評(píng)價(jià)

有研究表明，TPA測(cè)試能夠使品嘗指標(biāo)量化，便于數(shù)據(jù)處理和分析，且測(cè)試數(shù)據(jù)與感官評(píng)價(jià)具有顯著相關(guān)性。高品質(zhì)的饅頭不僅要求外觀飽滿、光滑、色澤均勻，還要求內(nèi)部氣孔分布均勻，質(zhì)地致密，紋理清晰且呈現(xiàn)出海綿狀的結(jié)構(gòu)。對(duì)4組發(fā)酵的饅頭分別從表皮色澤、內(nèi)部組織、比容、彈性、氣味5個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。由圖7可知，4組饅頭感官評(píng)價(jià)顯示，蘑菇醇濃度為1mg/mL時(shí)，饅頭評(píng)價(jià)得分最高，為91分，與質(zhì)構(gòu)測(cè)試結(jié)果一致。除在饅頭氣味得分方面略差，其他指標(biāo)表皮色澤、內(nèi)部組織、比容、彈性等均為最高分。蘑菇醇屬天然等同香料，因具有濃烈的蘑菇香味、薰衣草、玫瑰和干草香氣，可賦予饅頭特殊香味。但因個(gè)體差異不同，部分感官評(píng)價(jià)人員對(duì)此味道的接受性較差，因此可作為差異化產(chǎn)品補(bǔ)充市場(chǎng)。

結(jié)論

經(jīng)二倍稀釋法測(cè)定和牛津杯法驗(yàn)證，蘑菇醇對(duì)所測(cè)試的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌具有抑制作用。MIC為1mg/mL，MBC為2mg/mL，對(duì)所測(cè)細(xì)菌具有優(yōu)異的抗菌效果。經(jīng)MIC濃度的蘑菇醇處理后FCM結(jié)果顯示指示菌受損細(xì)胞比例大幅增加，倒置熒光顯微鏡顯示紅色熒光增強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證，蘑菇醇對(duì)細(xì)胞膜有破壞作用，可使其活性降低或失活。以1mg/mL將其添加到饅頭中，可以顯著降低饅頭中細(xì)菌總數(shù)和霉菌/酵母菌數(shù)量、增大比容、降低硬度，使饅頭擁有特殊香味，感官評(píng)價(jià)得分最佳。綜上所述，蘑菇醇作為天然成分為常溫饅頭保鮮提供了一種新的方式。

參考資料：

[1]周偉濤，鄭 琦，王曉杰，等．蘑菇醇的抑菌活性及其在饅頭保鮮中的應(yīng)用[A]．食品科技.2024,49(7):147-155.