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研究前沿 | 雙孢蘑菇提取物的抗菌活性及其與抗生素的協(xié)同作用

發(fā)表時間：2024-10-12 08:56

盡管抗生素?zé)o疑在改善人類健康和預(yù)期壽命方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但對目前臨床使用的抗生素對細(xì)菌感染無反應(yīng)的情況大幅增加?？刮⑸锬退幮缘淖钪匾?qū)動因素是人類和動物對抗生素的使用不足和不合理，這反過來又導(dǎo)致耐藥菌株的選擇、存活和傳播。其中，不能用標(biāo)準(zhǔn)療法治療的耐多藥病原體尤其令人關(guān)注。盡管世界衛(wèi)生組織認(rèn)識到抗生素越來越無效，但目前只有少數(shù)新藥在研制中。因此，迫切需要新的抗微生物策略。

為了保持現(xiàn)有抗生素的有效性并限制耐藥菌株的傳播，必須明智地使用藥物，并將其與各種預(yù)防策略結(jié)合使用。在這種情況下，人們正在探索天然產(chǎn)物作為治療和預(yù)防細(xì)菌感染的有希望的替代品。蘑菇以其多種藥理作用而聞名，包括抗氧化、抗炎、降糖、降血脂、保肝、抗癌和益生元特性，以及它們對細(xì)菌感染的保護(hù)作用。

最廣泛食用的蘑菇品種之一是雙孢蘑菇，其因低卡路里，缺乏飽和脂肪和膽固醇，以及富含必需氨基酸，維生素和纖維而受到贊賞。雙孢菇有兩種顏色狀態(tài)，包括白色和棕色，一般不認(rèn)為具有藥用價值。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它含有多糖、糖蛋白、三萜、植物化學(xué)物質(zhì)、酚類化合物和類黃酮，所有這些都強(qiáng)烈表明它可能具有一定的治療潛力。這一假設(shè)得到了一些報道的支持，即雙孢菇具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎和抗菌活性。

為了進(jìn)一步探索這種易于培養(yǎng)的蘑菇的潛力，本研究評估了白色和棕色雙孢蘑菇的乙醇和丙酮提取物對非致病性、致病性和耐多藥菌株的抗菌活性。此外，我們還評估了雙孢菇提取物與抗葡萄球菌抗FASII藥物AFN-1252聯(lián)合治療耐多藥金黃色葡萄球菌的潛在協(xié)同作用。

雙孢蘑菇提取物及孔擴(kuò)散試驗

白蘑菇(W)和棕色蘑菇(B)的乙醇(E)和丙酮(A)提取物的提取率、總酚含量和總蛋白質(zhì)含量見表1。酚類化合物是一大類真菌代謝產(chǎn)物，具有廣泛的生物效應(yīng)，包括抗菌和抗氧化活性。除此之外，多種蘑菇蛋白已被證明具有抗真菌、抗病毒和抗菌特性。兩種萃取劑中，乙醇比丙酮萃取得率更高。令人驚訝的是，白蘑菇的丙酮提取物提取率最低，但總蛋白質(zhì)含量最高(表1)。這表明白雙孢菇中高極性化合物(如蛋白質(zhì)和肽)或高分子量不溶性化合物的含量增加。

表1. 兩種不同萃取劑對雙孢菇總酚類化合物和總蛋白含量的影響

雙孢菇提取物及孔擴(kuò)散試驗

以甲醇為對照，采用孔擴(kuò)散法初步評估提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的抑菌活性(圖1a)。4種提取物均有抑菌作用，但均在抑菌帶內(nèi)生長。正如預(yù)期的那樣，細(xì)菌的生長完全被甲醇阻斷。實驗結(jié)果表明，復(fù)合菌體提取物具有抗菌作用，但對這些提取物有抗性的菌落仍能在抑制區(qū)內(nèi)生長。

圖1，瓊脂孔擴(kuò)散實驗顯示雙孢蘑菇提取物的抗菌作用(a)。用茴香醛試劑衍生化后的蘑菇提取物的HPTLC指紋圖譜((b)，左平板)和與四種菌株孵育的蘑菇提取物的HPTLC生物圖譜((b)，右平板)。EW，白雙孢蘑菇乙醇提取物；EB，棕色雙孢蘑菇乙醇提取物；AW:白色雙孢菇的丙酮提取物；AB，褐色雙孢菇的丙酮提取物。

主成分分析

采用主成分分析(PCA)對所測菌株的抑菌活性進(jìn)行比較。前6個主要分量描述了數(shù)據(jù)中88.56%的總變異性(PC1-27.34%、PC2-26.31%、PC3-11.91%、PC4-11.01%、PC5-7.49%和PC6-4.49%)。圖2a描述了基于其對給定菌株的抗菌活性的不同提取物的分離，用主成分PC1和PC4表示。

圖2：基于抗菌HPTLC生物圖譜的主成分分析（PCA）：數(shù)據(jù)的樣本/得分圖（a）、PC1數(shù)據(jù)的變量/負(fù)荷圖（b）和PC4數(shù)據(jù)的變量-負(fù)荷圖（c）。EW，白色雙孢蘑菇的乙醇提取物；EB，褐色雙孢蘑菇的乙醇提取物；AW，白色雙孢蘑菇的丙酮提取物；AB，棕色雙孢蘑菇的丙酮提取物。

在PC圖中，根據(jù)每次測定中使用的菌株，有一個明確的分組模式（圖2b，c）；使用四種菌株獲得的色譜圖沿著PC1軸聚集成四個不同的組。來自大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的數(shù)據(jù)在左側(cè)形成一個聚類，而致病性金黃色葡萄球菌和MRSA則在PC評分圖的右側(cè)聚集。然后，從抑制大腸桿菌中分離出影響革蘭氏陽性菌生長的成分。在革蘭氏陽性生物色譜圖中，物體分布不均勻，但顯示出明顯的相互分離。PC1與射頻0.11、0.86和0.94處的譜帶呈負(fù)相關(guān)。此外，在RF 0.32和0.90處的條帶將MRSA測定與沿著PC1軸使用其他菌株的測定區(qū)分開來。最后，在RF 0.11、0.86和0.94處的強(qiáng)表達(dá)帶對沿著PC1軸的分離產(chǎn)生負(fù)面影響。沿著PC4軸，來自枯草芽孢桿菌和MRSA的生物色譜圖的物體在上側(cè)的聚集受到RF 0.7、0.11、0.94和0.97處的活性帶的影響。從大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生物色譜圖中獲得的物體被定位在PC4軸的下部，并且這種分離受到RF 0.40和0.64處的帶的影響。

這樣，PCA能夠有效區(qū)分影響不同菌株生長的生物活性成分，沿PC1和PC4軸有明顯的分離。分離的條帶在分化過程中起著至關(guān)重要的作用，特別是影響革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的分布。這種分析方法強(qiáng)調(diào)了PCA在簡化抗菌劑鑒定方面的潛力，從而有助于有針對性地治療細(xì)菌感染。

協(xié)同雙療法

AFN-1252，一種FASII途徑的抑制劑，被用作對抗金黃色葡萄球菌感染。然而，在動物和人類中，該物種已被證明繞過突變進(jìn)化，從而能夠利用外源性脂肪酸來補(bǔ)償FASII抑制。由于適應(yīng)AFN-1252的金黃色葡萄球菌變體可能構(gòu)成新的、潛在的無法治療的感染的宿主，因此有必要找到維持這種治療效果的方法。一種可能的方法是將AFN-1252與協(xié)同治療相結(jié)合，這將增強(qiáng)其對抗葡萄球菌感染的效率，并有助于預(yù)防慢性疾病。

為了確定蘑菇提取物是否與AFN-1252具有協(xié)同作用，在指數(shù)生長階段用單獨的提取物或提取物與AFN-1252的混合物處理金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物。在補(bǔ)充有脂肪酸的BHI肉湯中監(jiān)測生長，以使細(xì)菌能夠繞過AFN-1252的作用，即將脂肪酸結(jié)合到膜脂質(zhì)中，從而免除對FASII的需要。在該培養(yǎng)基中，兩種金黃色葡萄球菌菌株(RN-4220和USA300-JE2(MRSA））都能夠適應(yīng)AFN-1252，并在10小時潛伏期后開始指數(shù)生長。四種蘑菇提取物只能微弱地抑制細(xì)菌細(xì)胞的增殖，白色雙孢蘑菇（EW）的乙醇提取物會導(dǎo)致短暫的2小時生長延遲。然而，當(dāng)AFN-1252和乙醇提取物一起使用時，抗FASII潛伏期顯著長于單獨使用抗生素時，并且在暴露于AFN-1252和AW提取物的培養(yǎng)物中，細(xì)菌生長被完全抑制。有趣的是，AFN-1252和AB提取物的組合完全抑制了菌株RN-4220的生長，但僅部分抑制了MRSA的生長。

雙孢菇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄菌的生長表現(xiàn)出顯著的抑制作用。生物自動圖譜顯示，本研究的提取物含有幾種具有菌株特異性作用的抗菌化合物。主成分分析強(qiáng)調(diào)了負(fù)責(zé)區(qū)分菌株的主要標(biāo)志物。此外，當(dāng)蘑菇提取物與抗生素AFN-1252結(jié)合時，觀察到協(xié)同抗菌作用，特別是白色雙孢蘑菇的丙酮提取物，其完全阻斷了金黃色葡萄球菌繞過AFN-1252活性的能力?；谶@些結(jié)果，假設(shè)雙孢菇中的生物活性化合物可能會破壞細(xì)菌細(xì)胞壁或代謝途徑，從而提高傳統(tǒng)抗生素的效力?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)突出了天然蘑菇產(chǎn)品在抗生素耐藥性不斷上升的情況下作為當(dāng)前抗菌治療的替代品或補(bǔ)充劑的潛力。